《Nature Materials》有关ctDNA甲基化标志物早期诊断和预测肝癌预后的研究

2017年10月9日，我中心徐瑞华教授与美国加州大学圣地亚哥分校的Kang Zhang(张康)教授一同领导的中美科学家团队在国际学术权威刊物自然出版集团旗下《Nature Materials》杂志(影响因子39.737)在线发表了题为“Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma”的研究成果。

该研究发现，通过对少量(4~5ml)外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)特定位点甲基化水平的检测，可以对肝癌进行准确的早期诊断及疗效和预后预测。

肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，据统计2015年全国肝癌新发病例和死亡病例分别高达46.6万和42.2万，造成极为沉重的生命损失和公共卫生负担。

与其他恶性肿瘤类似，早期诊断能使肝癌患者获得更为有效的治疗，从而明显的改善预后。但是目前仍缺乏理想的肝癌早期诊断手段，甲胎蛋白(AFP)虽然在肝癌中有较高的特异性，但是其敏感性只有50-60%，并非肝癌早期诊断的理想标志物。

肿瘤患者外周血中可检测到肿瘤细胞坏死、凋亡所释放的ctDNA，由于其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，理论上可以利用ctDNA对肿瘤进行诊断，这一无创的“液体活检”(Liquid Biopsy)新技术已经成为当前肿瘤研究领域的热点之一。

与经典的组织活检技术相比，液体活检技术具有以下优点：

无创性，仅凭少量外周血标本即可完成检测，不会引起肿瘤播散;

实时性，可动态反应肿瘤细胞的遗传改变和演变进程，避免反复有创的组织活检;

全面性，反映的是体内肿瘤细胞的分子遗传信息的全貌，避免了瘤内异质性对组织活检结果的影响;

准确性，其所携带的分子遗传学信息来自原发肿瘤，具有高度敏感性和特异性。

DNA分子中CpG位点的甲基化是基因表达的重要调节因素，以往研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞呈现出基因组整体甲基化水平降低和抑癌基因启动子CpG岛甲基化水平升高的趋势。

在同一类型的肿瘤细胞中可检测到稳定和一致的特征性DNA甲基化改变，作为肿瘤发生过程中的早期分子事件之一，常导致相应的抑癌基因失活，因此可作为肿瘤早期诊断的理想标志物。

但是，ctDNA在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约20ng，并且混杂在更大量的正常游离DNA背景中，在这么微量的ctDNA中检测单个碱基的甲基化水平仍存在很多困难。

徐瑞华教授和张康教授研究团队首先从全基因组水平上对肝癌组织和正常血液DNA的485,000个CpG位点甲基化水平进行了比较，筛选出差异性最显著的位点;设计相应的锁式探针(Padlock probe)，对近两千例肝癌和正常人血浆中提取的微量ctDNA进行了甲基化PCR扩增和测序;确定了这些位点的甲基化水平后，进而通过大量的统计学分析和计算，并利用多种人工智能模拟的机器学习方法，最后分别筛选出10个和8个位点建立了诊断模型和生存预后模型。

该诊断模型在训练组715例肝癌患者和560例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了85.7%和94.3%，在验证组383例肝癌患者和275例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了83.3%和90.5%，均明显高于现有肝癌血清标志物AFP。并且该模型还能准确的区分肝癌患者和慢性肝炎(HBV/HCV)和脂肪肝患者，显示出在肝癌早期诊断中的巨大价值。

此外，该模型还能准确的反映肝癌患者的TNM分期、体内有无肿瘤残留、对治疗的反应以及有无复发等。而对1049例生存资料完整的肝癌患者，依据生存预后模型进行评分，低风险组患者的预后显著优于高风险组患者，显示出利用该模型可以准确预测肝癌患者的预后，有利于对不同的风险的患者进行更为个体化的治疗。

徐瑞华教授团队的这一成果是我国科学家在肿瘤甲基化液体活检领域发表的重要高水平论文，为肝癌的筛查、诊断、疗效监测与预后预测提供了新的有效手段。

我国是肝癌大国，全世界每年新发肝癌病例超过一半以上都在中国;广东又是肝癌大省，肝癌发病率和死亡率均居于全国前列，这一成果的进一步转化推广将极大的提高肝癌早期诊断的敏感性和准确性，有助于发现更多亚临床期的早期肝癌病例，还有利于开展更为有效的个体化治疗，对于提高肝癌患者的整体疗效具有重大意义，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会经济效益。

中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授为该论文的第一和共同通讯作者，美国加州大学圣地亚哥分校基因组医学研究所所长、生物材料和组织工程研究中心主任张康教授为共同通讯作者，中山大学肿瘤防治中心韦玮、骆卉妍副教授作为共同第一作者完成了该项目的主要工作，郭荣平教授、赵齐博士后为本课题做出了重要贡献。

中美科学家团队密切协作，以科学问题为导向，密切结合临床实践需要和我国国情，经过艰苦的探索，先后攻克了稳定提取微量ctDNA、提高重亚硫酸盐转化效率、靶向甲基化PCR扩增及测序、海量数据的统计学分析处理等一个个技术壁垒，成功完成了这一跨学科、跨国界的重大科技合作项目。

中美科学家们将继续密切合作攻关，力争将ctDNA甲基化标志物应用到其他的常见实体肿瘤，如肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等的筛查、诊断、疗效监测及预后预测等，为提高恶性肿瘤的早诊早治率，改善患者的生存预后，作出更为巨大的贡献。