《自然》子刊: 癌症患者血液中大部分突变不是来自于癌细胞！

纪念斯隆·凯特琳癌症中心（MSKCC）和GRAIL联合研究团队，今天带来一项重要研究成果。

这项由MSKCC实验病理学主任Jorge Reis-Filho和临床医学科学家Pedram Razavi共同领导的研究，对124例癌症患者的cfDNA、肿瘤组织样本和白细胞DNA，以及47名无癌志愿者的cfDNA和白细胞DNA，进行了超高深度测序（60000×）。

他们发现，肿瘤患者血液cfDNA中携带的大部分基因突变，可能不是来自于癌细胞，而是血液中白细胞。

具体说来，在癌症患者的cfDNA中，克隆性造血带来的变异可能占53.2%；而在健康的志愿者体cfDNA中，这一数字能达到81.6%。这意味着，克隆造血带来的突变比科学家原来认为的要常见的多。

“看到这个结果，我们差点儿从椅子上掉下去。”Reis-Filho说[1]。

这也给液体活检相关的研究提出了挑战，在给患者开展液体活检时，白细胞DNA应该是必检项目，甚至需要开展超高深度的测序。

Pedram Razavi、David N. Brown和华人科学家Bob T. Li是共同第一作者。研究论文发表在顶级期刊《自然·医学》上[2]。

▲ 从左到右：Pedram Razavi，Jorge Reis-Filho，Bob Li（图源：MSKCC）

我们都知道，随着人体各种细胞的死亡破裂，细胞的DNA会释放到血液中，这些DNA就构成循环游离DNA（cfDNA）。同理，肿瘤细胞也会死亡，并往血液中释放游离DNA，这就是我们所熟悉的循环肿瘤DNA（ctDNA）[3，4]。很显然，ctDNA只是cfDNA中带有基因变异的那一小部分[5-7]。

ctDNA的发现，让科学家对癌症的液体活检技术寄予厚望。

虽然科学家想到了很多方法研究ctDNA[8-10]，但是仍难摆脱多种混杂因素的影响[11]。

其中影响比较大的一个是克隆性造血。

克隆性造血是那些有基因突变的造血干细胞，通过多系造血分化，形成携带同样突变的终末分化成熟血细胞[12]。虽然其中一些突变会导致后代血细胞具备适应性优势，出现不成比例的扩增[13]，但是这种克隆性扩增并不是恶性的。

克隆性造血会随着年龄的增长而增加，之前有研究表明31%的老年人都会出现克隆性造血[14]。而且，导致克隆性造血的基因突变，也可以通过cfDNA检测到[15]。

Reis-Filho等认为，克隆性造血肯定会影响肿瘤学家对cfDNA测序结果的解释，尤其是很大一部分cfDNA片段源自造血细胞[16]。

▲ 图片来自pixabay.com

尽管大量的研究表明，通过cfDNA检测到的基因突变，与通过肿瘤组织检测到的基因突变有很好的一致性[10]。不过，还是有科学家在cfDNA中发现了很多肿瘤组织中不存在的基因突变[6]。当然啦，这部分突变有可能是因为组织活检取样的不全面带来的，也有可能是克隆性造血导致的。

关于这个问题，Reis-Filho等认为需要好好研究一番。

在2015年9月到2016年8月之间，研究人员一共招募了124名晚期未经治疗或者进行性转移的癌症患者，其中乳腺癌（MBC）患者39名，非小细胞肺癌（NSCLC）患者41名，前列腺癌（CRPC）患者44名。另外还招募了50名没有癌症的志愿者，作为对照样本，不过最终只有47名无癌志愿者的样本有评估价值。

研究人员从癌症患者身上获取了肿瘤组织样本、cfDNA和白细胞DNA，从无癌志愿者身上获取了cfDNA和白细胞DNA样本。

获取样本之后，他们基于已经获得FDA批准的MSK-IMPACT平台，给每个样本独立开展了深度高达60000×的测序（这个测序深度，成本该有多高……）。

▲ 实验流程图

从总体上看，基于肿瘤组织的活检发现了740个突变，基于cfDNA的检测包含其中的530（71.6%）。具体到各个癌种的话，比例也是类似的，乳腺癌72%，非小细胞肺癌和前列腺癌是71%。

而且，在cfDNA发现的基因突变中，有一些突变虽然在肿瘤组织检测中出现，但是频率极低，还有一些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过（研究人员把它们叫做VUSOs）。

在确定了他们这个高深度测序方法的准确性和敏感性之后。研究人员推测，那些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过突变，可能反应了肿瘤的进化和异质性。而携带这部分变异的肿瘤组织，可能没有被活检采集到。

通过以上数据，我们不难发现，cfDNA检测和基于组织的活检还是存在一定的差异的。

▲ cfDNA检测的主要基因突变分析

紧接着，研究人员又开展了一项探索性分析：是否可以通过cfDNA评估TMB、肿瘤突变特征和MSI。

分析发现，肿瘤组织活检发现了6个高TMB的样本，其中4例样本也被cfDNA判定为有高TMB。不过，cfDNA还判定另外6个样本为高TMB样本，但是肿瘤组织检测结果不支持cfDNA的结果。

在cfDNA确定的10个高TMB样本中，有75%的突变是在肿瘤组织中出现频率低，以及在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过的。据此，研究人员进一步推测，这可能确实是肿瘤的空间异质性导致的，它们只在一些部位出现超突变，而这个部位恰恰没有被组织活检取到样。随后的基因分析也从侧面佐证了上述结果。

总结以上数据，研究人员认为，cfDNA测序可以准确检测整个肿瘤基因组中很大一部分的突变，或许可以反映患者肿瘤的TMB、肿瘤突变特征和MSI。而且，cfDNA可以检测到肿瘤组织活检发现不了的亚克隆突变。

▲ TMB分布图

随后，研究人员又分析了cfDNA检测到的突变生物学来源。在无癌的志愿者样本中，cfDNA检测到的突变（364），有81.6%（297）出现在了白细胞DNA中；而在癌症患者群体中，cfDNA检测到的1727个突变，有53.2%（918）出现在了白细胞DNA中。

并且通过一系列的分析，研究人员认为，通过cfDNA进行超高深度测序发现的基因突变，不太可能是技术本身带来的假阳性。而且，之前研究中开展的的白细胞DNA低深度测序[14，17-20]，可能大大低估了克隆性造血的普遍程度。

总之，在Reis-Filho团队看来，他们提出的这种超高深度cfDNA测序分析，确定克隆性造血突变是cfDNA中非肿瘤突变的最可能来源。而且这个比例相当惊人，至少在这个研究中，93.6%的无癌志愿者的白细胞携带一个克隆性造血突变，而这一比例在癌症患者群体中竟高达99.1%。

▲ 实验设计过程图

最后，论文作者在文章的讨论部分指出了一个有趣的现象。他们认为，当前大多数临床的cfDNA检测，都没有同时检测白细胞的DNA。结合着这个研究成果来看，这种不同时检测白细胞DNA的做法，肯定是不合适的。

不过，我今天特地了解了几个国内头部肿瘤测序公司的情况，基本都在检测cfDNA的同时，检测了白细胞的DNA，只是测序深度远低于MSKCC这个研究。

无论如何，这个研究一方面证明了cfDNA检测相较于组织活检的优点，另一方面也警示相关研究人员，在检测cfDNA的同时，一定要检测白细胞的DNA，最好是超高深度测序。

参考资料：

[1].https://www.mskcc.org/blog/many-mutations-detected-liquid-biopsy-tests-do-not-come-cancer-cells-msk-study-finds

[2].Razavi, P., Li, B.T., Brown, D.N, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nature medicine, 2019.  doi:10.1038/s41591-019-0652-7

[3].Leon S A, Shapiro B, Sklaroff D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J]. Cancer research, 1977, 37(3): 646-650.

[4].Stroun M, Anker P, Lyautey J, et al. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients[J]. European Journal of Cancer and Clinical Oncology, 1987, 23(6): 707-712.

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