最全总结丨关于液体活检，你想知道的都在这里！

肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游离肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。

正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。

由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。

要了解液体活检具体的应用场景，首先应明确液体活检的优劣势。

液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。

然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。

1. 早期诊断

肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。

值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。

因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%^[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。

2. 指导靶向治疗

肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》^[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但是若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。

由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。

但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。

3. 耐药监测

靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药^[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。

4. 预后评估

在预后评估方面，微小残留病变（MRD）是目前研究的热点。MRD指的是治疗后传统影像学和实验室方法无法发现，但通过分子诊断可以发现的肿瘤来源的分子异常。多种肿瘤的相关研究表明，ctDNA突变状态可提示接受根治性治疗的患者的预后复发，并且已经在部分临床实验中得到应用。

但是正如2021年发表于循证医学的《引领肺癌治疗新时代的标记物——微小残留病灶》述评^[4]中指出的，MRD检测还面临诸多问题，比如用何种方法来进行ctDNA MRD检测，如何兼顾灵敏度和成本效益，用何种标准来进行判读等。如今大部分肺癌相关临床试验突出的是MRD的阳性预测价值，而将MRD作为治疗预测标记物的研究并不多。

血液的规范化处理是保证液体活检结果准确的基本前提。在血液样本的送检方面应注意以下几点：

1. 采血管的选择

用于ctDNA检测的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA专用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液离体后应尽量保存于4℃，2小时内需尽快进行血浆分离；若使用cfDNA专用采血管，血液可在常温保存3-5天。切记严禁使用肝素抗凝管，因为肝素在后续DNA提取过程中难以去除，并且会抑制PCR反应，导致后续ctDNA检测失败。

2. 采血量及采血注意事项

一般而言，ctDNA检测需要采集8-10ml的全血^[2]。采血后严禁剧烈震荡血液，或者使用注射器针头对血液进行转移，因为这样的操作均会导致血液中细胞破裂，从而造成基因组DNA的污染，增加ctDNA检测的假阴性；此外溶血造成血红蛋白及其代谢产物的大量释放，从而抑制PCR扩增效率。采血后应轻柔将采血管颠倒8-10次进行混匀。

3. 患者采血时间的选择

一般建议患者空腹进行抽血，特别是血脂较高的患者。这是由于低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收的作用，会干扰后续ctDNA的相关检测；三酰甘油会降低ctDNA的提取率；若使用微滴式数字PCR检测技术，血液中的脂质会影响后续微滴的生成。此外，对于正在进行化疗的患者，一般建议患者化疗结束后进行抽血。

肺癌的罕见靶点主要指的是发生率低于5%的驱动基因变异。虽然发生率低，但是结合我国肺癌人群的庞大基数，此部分患者数量依然众多。由于这部分驱动基因变异的发生率较低，结合卫生经济学、肿瘤组织量的限制及检测流转时间（turn around time）的要求，推荐使用NGS技术来进行罕见靶点的检测。

应注意的是，选择NGS对罕见靶点进行检测时，应注意选择panel的大小及是否覆盖所需要检测的靶点；ALK、ROS1、RET等基因的融合，应注意panel对融合基因的内含子的覆盖度（因为融合断裂点大多数位于内含子，内含子覆盖度低可能造成融合检测的假阴性）；对于基于DNA NGS测出的罕见融合，或者DNA NGS检测驱动基因全阴性但临床高度怀疑存在驱动基因变异的人群，建议有条件的话使用RNA NGS进行进一步验证^[5]。

参考文献：

[1]Jin P, Kang Q, Wang X, Yang L, Yu Y, Li N, et al. Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm. Journal of gastroenterology and hepatology. 2015 May;30(5):830-3. PubMed PMID: 25471329.

[2]吴一龙. 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识. 中华医学杂志. 2015.

[3]O’Kane GM, Barnes TA, Leighl NB. Resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, T790M, and clinical trials. Current oncology. 2018 Jun;25(Suppl 1):S28-S37. PubMed PMID: 29910645. Pubmed Central PMCID: 6001758.

[4]张嘉涛, 杨学宁, 吴一龙. 引领肺癌治疗新时代的标志物——微小残留病灶. 循证医学. 2021;21(1):5.

[5]Li W, Guo L, Liu Y, Dong L, Yang L, Chen L, et al. Potential Unreliability of Uncommon ALK, ROS1, and RET Genomic Breakpoints in Predicting the Efficacy of Targeted Therapy in NSCLC. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2021 Mar;16(3):404-18. PubMed PMID: 33248323.