随着分子病理诊断技术及靶向药物研发不断进步，NSCLC的靶向治疗不断取得新进展。通过基因检测诊断鉴别药物敏感突变，筛选适合靶向用药的患者对NSCLC临床诊疗具有积极意义。伴有ALK基因融合的肺癌是NSCLC的一个重要临床亚型，ALK基因融合在非鳞NSCLC中的发生率约为5%-8%[1]。
近年来，ALK抑制剂的研发和临床应用取得了较大的突破，阿来替尼等ALK抑制剂对ALK阳性晚期NSCLC患者具有显著疗效。因此，通过准确、快速、恰当的ALK检测方法，筛选出适用ALK抑制剂的目标人群对于延长ALK+NSCLC患者生存时间具有重要临床意义。下面本文将详细介绍ALK阳性NSCLC患者的四大常用检测技术，以及检测技术的最新临床研究进展。
目前多种ALK基因融合突变的诊断方法如免疫组化（IHC）、原位杂交（FISH）、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、二代测序（NGS）在临床实践中均得到广泛应用。2019年颁布《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》的专家组强烈推荐这4种方法均可用于ALK基因融合检测，检测需依据临床具体情况及实验室条件进行检测方法的选择，并通过必要的性能验证或性能确认，确立检测分析前、分析中和分析后全流程的标准操作程序[2]。
● ALK Ventana-D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法，二元结果判读标准简单。然而，在临床实践中要警惕ALK Ventana IHC结果判读中存在的一些陷阱，避免假阳性或假阴性。对于非Ventana-D5F3 IHC检测，共识推荐其可用于ALK检测结果初筛[2]。
● FISH是目前临床检测NSCLC ALK基因融合的“金标准”之一，该技术相对快速、标准化，但比较昂贵，并且对人员、设备、检测过程、结果判读要求较高，存在主客观因素的偏倚。
● RT-PCR检测ALK融合基因表达方法的灵敏度和特异度均较高，但因为RT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性可能。同时，因涉及基于mRNA的PCR扩增，其对于检测环境和标本质量都有比较高的要求，因此应强化内、外部质控，避免污染。
● NGS在基因检测中的地位越来越高，除了点突变，也可以检测基因易位，同时可以和其他基因如表皮生长因子受体（EGFR）等几个乃至几百个基因一起检测。NGS可分为基于DNA水平的测序和基于RNA水平的测序。在RNA水平上采用扩增子的测序方式具有很高的检测灵敏度和特异度，而且极少的RNA投入就能够在转录水平检测到ALK融合基因表达。
ALK阳性NSCLC患者面对4种检测技术，应当如何选择？近期有4项新研究对几种检测技术进行了比较。
在2019年1月至2019年12月期间，一项研究[3]共招募了302例NSCLC患者，患者的样本为福尔马林固定石蜡包埋样本，分别用IHC（D5F3, Ventana）和RT-PCR（AmoyDx）检测ALK基因。分子评估时，大多数患者（97.0%）为初治患者。IHC显示出18例ALK阳性患者；RT-PCR显示出14例ALK阳性患者，其中4例患者的IHC结果和RT-PCR结果不一致，如下表所示（表1）。
因此利用NGS进行复检，结果发现出现了新的罕见融合，如WDPCP-ALK融合、CLTC-ALK融合、PLB1-ALK融合。WDPCP-ALK融合首次在肺腺癌中被发现；CLTC-ALK融合在弥漫性大B细胞淋巴瘤中首次被报道，随后在其他肿瘤中被报道，但在肺癌中未有报道；PLB1-ALK融合是一种新型的头对头融合基因。
此外，P10患者的IHC结果为阳性，RT-PCR结果为阴性，DNA-NGS检测也为阴性，而RNA-NGS检测为STRN-ALK融合，该融合在甲状腺癌中最常见，在肺癌和腹膜间皮瘤中也有报道，对ALK抑制剂有极好的应答。结合既往的研究来看，基于RNA水平的NGS检测对于融合基因检测来说或许更有优势。
另一项研究[4]比较了RT-PCR和NGS检测中国NSCLC患者ALK基因的效果，研究收集2017年11月至2019年10月期间病理诊断为NSCLC的153例患者的福尔马林石蜡包埋组织，进行RT-PCR和NGS检测，对于ALK状态不一致的样品，采用FISH或Sanger测序进一步确认ALK状态。
结果显示，共124份样品成功使用NGS和RT-PCR检测，118份样本的NGS与RT-PCR结果一致，其中25份为ALK融合阳性，93份为ALK融合阴性。总体来说，两种方法的一致性较高，且无统计学差异，一致率约为95%（表2）。
对于6份NGS与RT-PCR检测结果不一致的样本，FISH/Sanger测序复检时的结果显示：在5份NGS结果阴性+RT-PCR结果阳性的样本中，3份复检为阳性，1份复检为阴性，1份复检为不可用（NA）；对于1份NGS结果阳性+RT-PCR结果阴性的样本，复检仍是阳性（表3）。
还有一项研究[5]评估了DNA-NGS未发现致病性驱动基因突变的患者，使用RNA-NGS在鉴定基因融合和外显子跳跃中的优势，研究比较了平行检测（DNA-NGS和RNA-NGS，n=198）与顺序检测（先检测DNA-NGS，无基因突变的再使用RNA-NGS，n=192）。
结果发现，在两个队列中，每个病例最多发现一个致癌驱动基因突变，这与大型的全基因组数据库一致，且表明当在DNA-NGS中鉴定出明确的致癌驱动因子时，省略RNA-NGS检测是安全的。对于从不吸烟的肿瘤患者，融合和外显子跳跃突变较为多见。考虑到平行检测的周转时间更短，平行检测对从不吸烟者优势更明显。
最后研究者总结道：对于吸烟相关的NSCLC，DNA-NGS和RNA-NGS顺序检测是突变和融合检测的最有效策略。而对于从不吸烟者，建议采用平行检测的方法（图1）。
图1. 从不吸烟者、有吸烟史或者正在吸烟的患者的检测策略和诊疗流程
还有一项研究[6]旨在确定ALK融合阳性的年轻NSCLC患者的分子特征和临床结局，研究纳入2016年1月至2018年12月获得的组织学标本，对1652例接受NGS检测的肺癌患者的基因组谱进行了调查，结果发现101例患者中有ALK基因融合，其中52例患者在50岁前确诊，为早发型疾病。在52例早发型疾病患者中，不吸烟患者有43例（82.7%）。研究发现ALK融合在年轻患者中更为普遍，与老年患者相比，年轻患者更有可能携带EML4-ALK变体1(38.5% vs. 14.3%，P=0.007)。
研究者指出，年轻的、不吸烟的NSCLC患者更易发生ALK融合突变，为了不漏检任何一个ALK+患者，可考虑在Ventana IHC初筛的同时，进行PCR/NGS的平行检测，根据检测结果指导下一步的治疗。
近期全球首个仅通过血液NGS指导药物选择的BFAST研究结果显示[7]，阿来替尼一线治疗ALK融合阳性NSCLC患者的疗效不受EML4-ALK变体1或变体3的影响，客观缓解率（ORR）均在90%左右；阿来替尼对非EML4-ALK融合阳性患者也有疗效，ORR达79%。
表4. EML4-ALK融合与非EML4-ALK，EML4-ALK变体1与变体3患者的ORR分析
同时，阿来替尼对于EML4-ALK变体1或变体3的1年PFS率分别为87.3%和80.9%，HR 2.06（95% CI：0.51-8.25），无显著统计学差异（图4）。
图4.阿来替尼治疗EML4变体1或变体3的PFS结果
NSCLC发病率逐年升高，严重影响着人们的生命健康，其中ALK作为NSCLC常见分子基因突变，且晚期ALK阳性NSCLC患者可从ALK抑制剂治疗中显著获益，因此确保ALK检测结果准确对患者的筛选和疗效评估具有重要临床意义。IHC、FISH、RT-PCR和NSG均可用于ALK检测，医生可根据临床具体情况和实验室条件为患者选择最合适的检测方法。研究显示，年轻的、不吸烟的NSCLC患者更易发生ALK融合突变，为了不漏检任何一个ALK+患者，可考虑在Ventana IHC初筛的同时，进行PCR/NGS的平行检测，根据检测结果指导下一步的治疗。
[1].Imyanitov EN, Iyevleva AG, Levchenko EV.Molecular testing and targeted therapy for non-small cell lung cancer: Current status and perspectives.Crit Rev Oncol Hematol. 2021 Jan;157:103194.
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[3].Bei Wang , Rongrong Chen , Changxi Wang et al. Identification of novel ALK fusions using DNA/RNA sequencing in immunohistochemistry / RT-PCR discordant NSCLC patients.Hum Pathol. 2021 Aug;114:90-98.
[4].Yukun Kuang, Peihang Xu, Jiyu Wang et al.Detecting ALK Rearrangement with RT-PCR: A Reliable Approach Compared with Next-Generation Sequencing in Patients with NSCLC.Mol Diagn Ther. 2021 Jul;25(4):487-494.
[5].Danielle Cohen , Liesbeth M Hondelink , Nienke Solleveld-Westerink et al. Optimizing Mutation and Fusion Detection in NSCLC by Sequential DNA and RNA Sequencing. J Thorac Oncol. 2020 Jun;15(6):1000-1014.
[6].Tian P, Liu Y, Zeng H, et al. Unique molecular features and clinical outcomes in young patients with non-small cell lung cancer harboring ALK fusion genes. J Cancer Res Clin Oncol. 2020;146(4):935-944.
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